EL OBJETIVO DEL ESTE TRABAJO FUE INVESTIGAR LA RELACIÓN ENTRE EL CARÁCTER SECRETOR DE PACIENTES CON LESIONES ORALES PRE-MALIGNAS Y MALIGNAS Y LA EXPRESIÓN ANTIGÉNICA ABH EN CORTES HISTOLÓGICOS DE DICHAS LESIONES.

 

Material proporcionado por:

Dra. Claudia Biondi
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Dr. Carlos Cotorruelo
Dra. Silvia García Borrás
Dra. Vanina Valdez
Dra. Liliana Racca
Dra. Amelia Racca
Laboratorio de Inmunohematología e Inmunogenética. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Universidad Nacional de Rosario.

Dr. Campi Carlos
Dra. Livia Escovich
Cátedra de Estomatología. Facultad de Odontología. Universidad Nacional de Rosario.

Resumen

Los antígenos ABH, productos de la interacción de dos sistemas genéticos Hh y ABO, están sujetos a leyes de herencia y pueden estar localizados no sólo en los eritrocitos sino también en la mayoría de las células humanas.
El objetivo del este trabajo fue investigar la relación entre el carácter secretor de pacientes con lesiones orales pre-malignas y malignas y la expresión antigénica ABH en cortes histológicos de dichas lesiones.
Se trabajó con muestras incluidas en tacos de parafina de pacientes con lesiones orales. Los pacientes fueron clasificados en 2 grupos: a) lesiones premalignas y malignas y b) lesiones benignas. Se investigaron los antígenos ABH por la técnica de inmunoadherencia específica modificada. Se utilizó la adherencia al tejido vascular como control positivo y al tejido adiposo como control negativo. Los resultados fueron semicuantificados desde adherencia fuertemente positiva a negativa. El carácter secretor fue determinado por la técnica de inhibición de la hemaglutinación. En 21 de las 34 muestras se observó una débil expresión antigénica en áreas atípicas, y deleción total en las áreas histológicamente afectadas por neoplasia. En 8 muestras hubo pérdida total de los antígenos ABH tanto en áreas normales como patológicas, estos pacientes presentaron un mayor grado de malignidad y metástasis que aquellos que conservaron la antigenicidad. Los pacientes con lesiones orales pre-malignas y malignas presentaron un incremento del carácter no secretor (52.3%) respecto de la población control (19.5%), y de aquellos pacientes con lesiones orales benignas (15.4%). Se observó una importante asociación entre pacientes no secretores y deleción de los antígenos ABH en muestras de lesiones orales. Además, hemos encontrado en el grupo no secretor una mayor malignidad de las lesiones orales como así también una mayor presentación de displasia epitelial.
El estudio del carácter secretor en los pacientes con lesiones orales podría ser utilizado como un marcador en el desarrollo del cáncer oral.

Summary

ABH antigens, which arise from the interaction of two genetic systems Hh and ABO, may be located not only in the red blood cells but also in almost all cells in the human body. Changes of blood group determinants and modification of carrier carbohydrate chains are characteristic of essentially all common human cancers, and constitute important tumor markers. The aim of this work was to investigate the secretor status of patients with oral pre-cancerous and cancerous lesions and ABH antigens expression in fixed tissue sections of these patients.
To reveal A, B and H antigens in tissue sections of patients with precancerous and cancerous oral lesions (n= 34) we used a modified specific red cell adherence technique (SRCA-test). Normal endothelial cells expressed ABH antigens, the presence of indicator erythrocytes at the lumen of the blood vessels served as a built in positive control. A strongly positive reaction was defined as a sheet of indicator erythrocytes adhered to the epithelia cells. All were subjected to clinical oral examinations and standard evaluation tests in order to establish the secretor status of their saliva (agglutination inhibition technique).In 21 of the 34 samples analyzed the test showed slightly positive results on atypical areas, and there was a complete antigen deletion in areas histologically affected by neoplasia. Eight samples showed a total absence of ABH antigens in both histologically normal and pathological areas. The results obtained have demonstrated that the large majority of the people examined in the healthy group were secretor and there were significant difference between secretors and non-secretors in the experimental group. We also found a higher intensity of oral disease in the non-secretor group, and the occurrence of epithelial dysplasia was most found in the non-secretor group. As a working hypothesis, we propose that areas of SRCA-test negative epithelium are closely related to invasive carcinomas and may be their precursor lesions. Further it is suggested that areas of blood group isoantigen negative epithelium showing atypia, or in some instances near normal histology, may give rise to relatively low grade carcinomas. Considering these results we suggest the use of this method to monitor probable preneoplastic lesions in risk population, especially in those with no secretor status.

Palabras claves: antígenos ABH, carácter secretor, lesiones orales

Introducción

La expresión de los antígenos del grupo sanguíneo ABO, no está limitada a los glóbulos rojos, también están presentes en la superficie de otras células del organismo y en las secreciones. Estos antígenos confieren propiedades biológicas esenciales, participan en el recambio y el tráfico transcelular y tienen gran importancia para la interacción celular durante el desarrollo y crecimiento. Estos antígenos pluritisulares son productos secundarios de genes que codifican glucosiltransferasas específicas y su expresión está bajo regulación sinérgica de varios sistemas genéticos entre los que se encuentran el sistema ABO, Hh, Ii, Lewis, Sese y Zz. (1,2)
El 80% de los individuos son capaces de secretar los antígenos del sistema ABH en saliva, leche y otras secreciones. Este fenómeno está codificado por un gen que puede adoptar dos formas alélicas: Se (dominante) y se (recesiva). El gen Se no actuaría solamente en la capacidad de secretar antígenos ABH, sino que también contribuiría a la regulación de su expresión en los distintos tejidos. (2,3)
Por otra parte, existe amplia evidencia de el cáncer está asociado con anormalidades en la regulación génica que se expresa en la superficie de la membrana celular. Una alteración en ese mecanismo puede actuar por bloqueo directamente de las moléculas superficiales de la célula que median la interacción, o derivar su síntesis y organización del desarrollo y la diferenciación (4,5). Alteraciones en la expresión antigénica ABH en síndromes hematológicos malignos fue descripta primeramente por van Loghem, quien observó una débil expresión del antígeno A en un paciente con leucemia mieloide aguda. Actualmente la pérdida de la reactividad de los antígenos A, B, H de la superficie de los hematíes es reconocida como un fenómeno recurrente en procesos hematológicos malignos. En tumores, es posible encontrar cambios tanto en los glicolípidos como en las glicoproteínas (6,7). La mayoría de los estudios han investigado las alteraciones en los carbohidratos de la superficie celular. En recientes investigaciones, se ha demostrado que las modificaciones en la glicosilación participan en la mayoría de los fenotipos malignos, incluyendo señales de transducción y apoptosis (8,9) Considerando que la mayoría de los cánceres humanos se originan a partir de células epiteliales, los cambios en los grupos sanguíneos constituyen un tópico importante en la inmunología tumoral.
El objetivo de este trabajo fue investigar la relación entre el carácter secretor y la expresión antigénica ABH en cortes histológicos de pacientes con lesiones orales pre-malignas y malignas.

Materiales y métodos

Se trabajó con muestras de pacientes con lesiones orales pre-malignas y malignas (n=21) clasificados según el grado anatomopatológico, e individuos con lesiones orales benignas (n=13). Se analizó una población normal de individuos sin patología demostrable (n=41)
Se determinó el carácter secretor investigando los antígenos ABH solubles en saliva empleando la técnica de inhibición de la aglutinación (10). Las salivas estudiadas para determinar el carácter secretor fueron sometidas inicialmente a choque térmico para destruir la mucina que interfiere en las reacciones de aglutinación (10). Los antígenos ABH en células de cortes histológicos de pacientes con lesiones orales pre-malignas y malignas. fueron estudiados por la técnica de inmunoadherencia (11).
Técnica de inhibición de la aglutinación:
Se realizaron 3 baterías de diluciones geométricas al medio, del material en estudio en Buffer Fosfato Salino (PBS) pH 7,4. Se enfrentó cada batería con igual volumen de antisueros de distinta especificidad: anti-A, anti-B y lectina Ulex europeus, convenientemente diluidos. Los tubos se incubaron 10 minutos a temperatura ambiente y se revelaron con una suspensión de glóbulos rojos isogrupo al 5% en PBS.
Se centrifugó a 1000 RPM durante 1 minuto y se observó aglutinación macroscópica.
Con esta técnica se evalúa en forma indirecta el carácter secretor del paciente. Si presenta antígenos solubles, el paciente es secretor. Si carece de antígenos solubles el mismo es no secretor.

Técnica de inmunoadherencia

Las muestras de tejido proveniente de las lesiones orales pre-malignas y malignas (n=11) conservadas en taco de parafina fueron sometidas a cortes con micrótomo, de manera de obtener secciones de 4 mm de espesor, y posteriormente fueron adheridos sobre un portaobjetos. Luego se desparafinaron por cambios en solvente xilol y alcohol, se colorearon con hematoxilina y lavaron con buffer Tris-salina isotónico pH7,4 durante cinco minutos eliminando el exceso de buffer.
Las secciones fueron cubiertas durante diez minutos, a temperatura ambiente, con antisuero monoclonal anti-A, anti-B o lectina anti-H (Ulex europeus), en concentración óptima de acuerdo al grupo sanguíneo específico del paciente.
Los portaobjetos colocados en un vaso de Coplic se incubaron 3 veces con buffer Tris durante 15 minutos para eliminar el antisuero o la lectina anti-H en exceso. Cada sección fue cubierta con una suspensión de eritrocitos isogrupo al corte en estudio al 5% en PBS, durante 15 minutos. Los glóbulos rojos pueden adherirse a la sección de tejido, desparafinado vía antisuero o lectina.
Posteriormente, se colocaron los preparados invertidos, sobre dos barras soporte, en una caja de Petri conteniendo buffer Tris, para que los eritrocitos estén en contacto con la solución buffer, lo cual permite eliminar los eritrocitos no adheridos. Se incubó durante 30 minutos y se observaron microscópicamente.
Se utilizaron como controles positivos el tejido vascular y como controles negativos el tejido adiposo.
Interpretación:
Los resultados fueron semicuantificados desde adherencia fuertemente positiva (++++) a adherencia negativa (-). Se utilizaron para designar niveles intermedios de adherencia: + equivalente al 25% de adherencia, ++ a 50% y +++ a 75%.

Análisis estadístico

Se aplicó el test de chi.cuadrado para el análisis de posibles asociaciones entre las variables predictivas y de impacto en el estudio. Se calcularon razones de Odds y se estimaron los intervalos de confianza.

Resultados

En la población normal, el 79.5 % de los individuos resultaron ser secretores (coincidente con la bibliografía) expresando los antígenos ABH de acuerdo a su grupo sanguíneo eritrocitario.
En la tabla I se presentan los resultados correspondientes a los valores obtenidos en salivas de los pacientes con lesiones orales pre-malignas y malignas. Los mismos presentaron un incremento del carácter no secretor (52.3%) respecto de la población control (19.5%), y de aquellos pacientes con lesiones orales benignas (15.4%) (OR= 6.05; IC 95% de 1.185 a 30.0767; p= 0.03).
Los datos obtenidos de la expresión ABH en muestras de tejidos de lesiones orales se presentan en la tabla II. Se observa una asociación significativa entre pacientes no secretores y deleción de los antígenos ABH en muestras de lesiones orales (OR=16.00; IC 95% de 1.745 a 146.67; p= 0.0039).

Discusión

Los glucoconjugados de membrana de las células epiteliales presentan carbohidratos antigénicos relacionados con las sustancias de grupo sanguíneo. Durante la progresión a la malignidad, estos oligosacáridos inmunodominantes sufren alteraciones específicas. El cambio más frecuente y destacable en las determinantes de grupo sanguíneo asociado con cáncer humano es la deleción de antígenos de grupos sanguíneos A, B o H (6,7).
La mayoría de los estudios relacionados a la localización de los antígenos de grupo sanguíneo en los tejidos han indicado que los mismos corresponden al grupo sanguíneo eritrocitario, pero que su expresión tisular depende del estado secretor del individuo. (1,2)
En el presente trabajo, los resultados obtenidos, muestran que el carácter no secretor está aumentado en la población de pacientes con lesiones orales premalignas y malignas (53.5 %), respecto de la población normal (19.5%). Estos hallazgos indicarían que los pacientes no secretores con lesiones orales podrían desarrollar patologías con mayor grado de malignidad respecto de los pacientes secretores estudiados. Además, se observó en el grupo no secretor, una mayor malignidad en estas lesiones y aumento de ocurrencia de displasia epitelial. Por lo tanto, el estado no secretor, que es predominante en los pacientes con precáncer y cáncer oral, podría ser utilizado como un marcador en el desarrollo de dicha patología.
En el diagnóstico histopatológico de rutina, la clasificación del tipo de tumor está basada en la apariencia histológica de la mayoría de las partes diferenciadas del tumor. Por otro lado, el pronóstico de la enfermedad está relacionado parcialmente en el grado de diferenciación del tejido. En la mayoría de los casos el grado de diferenciación está determinado por la morfología celular del tejido analizado y por la capacidad de las células de sintetizar productos específicos tales como queratina y mucina. Previamente ha sido demostrado que la expresión de los carbohidratos sobre la superficie celular de epitelio estratificado está relacionado a la diferenciación celular (12; 13) En el presente trabajo, hemos utilizado la pérdida de la expresión de los antígenos ABH como marcador de diferenciación celular. Como la expresión de estos antígenos puede ser detectada a través de anticuerpos monoclonales, constituye un marcador de diferenciación más comúnmente utilizado en ensayos histológicos subjetivos. Se acepta que los tumores están compuestos por poblaciones celulares heterogéneas con distinto comportamiento biológico. Para obtener una óptima información del pronóstico sobre el tumor, se debería estudiar todas las subpoblaciones celulares. Si la biopsia recogida no es representativa del tumor, el estudio de la reactividad ABH puede ser relacionado con el grado del tumor en estudio. Esto podría ser valor diagnóstico y pronóstico de la patología en estudio. Estudios similares de deleción de antígenos ABH en cáncer de vejiga mostraron una asociación con peor pronóstico de la enfermedad.
El análisis de los cortes de tejidos demostró que los pacientes con mayor grado de malignidad, o con lesiones pre malignas presentaron una deleción total o parcial de los antígenos de grupo sanguíneo ABH. La pérdida antigénica observada en las células de lesiones pre malignas y malignas podría ser consecuencia de un paro en la maduración de los antígenos celulares, que afectaría también al sistema secretor. Además, la pérdida de la expresión de los antígenos en las secciones de tejido de las lesiones tumorales, se encuentra significativamente correlacionada con el grado del desarrollo del tumor y el grado de malignidad histológico.
Los antígenos A, B y H que están presentes en la superficie de los eritrocitos, también se encuentran en todos los tejidos epiteliales y endoteliales (12). Cuando las células normales se transforman en malignas estos antígenos se pierden y por lo tanto, esta deleción podría ser utilizada como una herramienta de diagnóstico para la detección y pronóstico del cáncer oral.

Tabla I: Carácter secretor en pacientes con lesiones orales

Tabla II: Estado secretor y estudio de los antígenos ABH en cortes histológicos de pacientes con lesiones orales

 

 

Bibliografía

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